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一、滲透壓法分子量測定
在理想溶液中,滲透壓是濃度的線性函數(shù),而與溶質(zhì)的形狀無關(guān).所以可用滲透壓計算蛋白質(zhì)的分子量.但是實(shí)際的高分子溶液與理想溶液有較大偏差,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度不大時,可用以下公式計算:
M=RT/lim(∏/C)。
其中R是氣體常數(shù)(0.082),T是絕對溫度,∏是滲透壓(以大氣壓計),濃度單位是g/L.測定時需測定幾個不同濃度的滲透壓,以∏/C對C作圖并外推求出C為零時的∏/C值,帶入公式求出分子量.此方法簡單準(zhǔn)確,與蛋白質(zhì)的形狀和水化程度無關(guān),但要求樣品均一。
二、沉降分析法分子量測定
蛋白質(zhì)在溶液中受到強(qiáng)大離心力作用時,如其密度大于溶液密度,就會沉降.用超速離心機(jī)(每分鐘6-8萬轉(zhuǎn))測定蛋白質(zhì)的分子量有兩種方法:沉降速度法和沉降平衡法.
1.沉降速度法 離心時,蛋白質(zhì)移動,產(chǎn)生界面,界面的移動可用適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)系統(tǒng)觀察和拍照.當(dāng)離心力與溶劑的摩擦阻力平衡時,單位離心場強(qiáng)度的沉降速度為定值,稱為沉降系數(shù).蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)(常用S20,w表示)介于1×10-13到200×10-13秒,1×10-13秒稱為一個漂浮單位或斯維德貝格單位.蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)與分子形狀有關(guān),所以測定分子量時還要測定有關(guān)分子形狀的參數(shù),如擴(kuò)散系數(shù).可用以下公式計算:M=RTs÷D(1-Vρ)
其中D是擴(kuò)散系數(shù),V是蛋白質(zhì)的偏微分比容,ρ是溶劑的密度.偏微分比容的定義是:當(dāng)加入1克干物質(zhì)于無限大體積的溶劑中時,溶液的體積增量.蛋白質(zhì)溶于水的偏微分比容約為0.74立方厘米每克.為獲得準(zhǔn)確結(jié)果,s和D的值應(yīng)外推到無限稀釋.其中的R是氣體常數(shù),在采用厘米.克.秒制時,等于8.314×107爾格/秒.
沉降分析還可鑒定蛋白均一性.純蛋白只有一個界面,在沉降分析圖形上只有一個峰.
2.沉降平衡法 在離心過程中,外圍高濃度區(qū)的蛋白質(zhì)向中心擴(kuò)散,如轉(zhuǎn)速較低,二者可達(dá)到穩(wěn)定平衡.此時測定離心管中不同區(qū)域的蛋白濃度,可按下式計算分子量:
M=2RTln(C2/C1)÷[ω2(1-Vρ)(x22-x12)]
其中C2和C1是離軸心距離為x2和x1時的蛋白質(zhì)濃度.沉降平衡法的優(yōu)點(diǎn)是不需要擴(kuò)散系數(shù),且離心速度較低(8000-20000轉(zhuǎn)每分).但要達(dá)到平衡常常需要幾天時間.
三、根據(jù)化學(xué)組成進(jìn)行分子量測定
用化學(xué)分析方法測出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量,并假設(shè)分子中只有一個這種元素的原子,就可以計算出蛋白質(zhì)的最低分子量.例如,肌紅蛋白含鐵0.335%,其最低分子量可依下式計算:
最低分子量=鐵的原子量÷鐵的百分含量×100
計算結(jié)果為16700,與其他方法測定結(jié)果極為接近,可見肌紅蛋白中只含一個鐵原子.真實(shí)分子量是最低原子量的n倍,n是蛋白質(zhì)中鐵原子的數(shù)目,肌紅蛋白n=1.血紅蛋白鐵含量也是0.335%,最低分子量也是16700,因?yàn)楹?個鐵原子,所以n=4,因此其真實(shí)分子量為66800.有時蛋白質(zhì)分子中某種氨基酸含量很少,也可用這種方法計算最低分子量.如牛血清白蛋白含色氨酸0.58%,最低分子量為35200,用其他方法測得分子量為69000,所以其分子中含兩個色氨酸.最低分子量測定只有與其他方法配合才能確定真實(shí)分子量.
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